RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤

一、实验目的

掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。

二、实验原理

RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1% 琼脂 糖凝胶即可。

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三、实验材料、器具及药品

蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪，电泳槽，电子 天平 ， 移液器 ，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。

四、实验步骤

（1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在 实验台 上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。

（3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。

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RNA的变性琼脂糖凝胶检测

试剂 ：

（1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS） (Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA 。

（2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。

（3）甲醛。

（4）去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇 干燥 ——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。

操作：

（1） 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。

（2） 配制琼脂糖凝胶。

①称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内 加热 使琼脂糖彻底溶化均匀。

②待胶凉至60--70 ℃，依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和0.5ul 溴化乙锭，混合均匀。

③灌制琼脂糖凝胶。

（3） 样品准备：

① 取 DEPC处理过的500ul小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS缓冲液2ul，甲醛3.5ul,甲酰胺（去离子）10ul，RNA 样品 4.5ul,混匀。

② 将离心管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。

③ 向管中加入3ul 上样染料，混匀。

（4）上样。

（5）电泳：电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于7.5V/ml 的电压下电泳。

（6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。

RNA跑电泳用什么好？

电泳是一种常用的实验室技术，可鉴定、定量和纯化核酸片段以及评估质量。RNA 分子带负电，在凝胶电泳期间向正极移动。

RNA 的长度通常决定了其在凝胶中的迁移，长RNA片段比短片段移动更慢。然而，RNA 分子通过分子内碱基配对而具有广泛的二级结构，这可能影响其凝胶迁移。对于大多数应用，使用变性条件进行RNA 电泳来破坏二级结构。对于分辨RNA 不同构象的应用，建议使用天然（或非变性）凝胶。

非变性RNA 电泳

非变性条件下的RNA凝胶电泳保留了RNA 分子的二级结构。琼脂糖通常优于丙烯酰胺，因为其毒性较低，并且在可分离典型RNA 分子的浓度下更易于处理。我们为非变性琼脂糖凝胶电泳提供了便捷试剂，包括方便的预制E-Gel™ 琼脂糖凝胶和用于您自制凝胶的UltraPure™ 试剂。

非变性RNA 电泳产品：

E-Gel™ 预制琼脂糖凝胶电泳系统

RNA Ladders

UltraPure™ 琼脂糖和试剂

Thermo Scientific™ RNA 电泳

变性RNA 电泳

为了准确测定RNA 片段的分子量，使用变性条件进行RNA 凝胶电泳是至关重要的。由于Northern 印迹通常是根据RNA 大小进行RNA 分子表征，因此通常在使用Northern 印迹进行RNA分析之前进行变性电泳。变性条件可破坏氢键，使RNA 作为单链分子电泳而不具有二级结构。变性试剂有很多选择，包括乙二醛、甲酰胺和甲基汞。这些化合物的缺点在于具有毒性，需谨慎处理。

传统上，甲醛被用作RNA 电泳的变性试剂。NorthernMax™ 试剂盒包含一套完整的无RNA 酶试剂，用于含甲醛琼脂糖凝胶电泳。这些凝胶必须在通风橱里操作。使用NorthernMax™-Gly 试剂盒，在电泳前需将RNA 样品置于乙二醛/DMSO 上样缓冲液中变性，随后在无甲醛的琼脂糖凝胶中电泳。

有多种RNA分子量标准可用于准确预估RNA 的分子量大小，包括Millennium™ 标记物。

rna电泳加多少核酸染料

rna电泳加TAE+1%的核酸染料。根据查询相关公开信息，rna电泳条件是120V、20-30min，胶：1%，TAE+1%核酸染料。核酸染料是一种灵敏、稳定和相对安全的荧光核酸染色试剂，是生物实验中不可或缺的一分子。

RNA 凝胶电泳注意事项

RNA 凝胶是用Northern 印迹的方法来分析RNA 。mRNA 大约只占总RNA 的5% ，在溴化乙锭染色的胶上看不到，因此mRNA 必须用标记探针来检测。

＊样品制备

RNA 样品在电泳之前及电泳过程中必须是变性的，否则不能精确测定分子质量。变性是由甲醛与甲酰胺来完成的，也可用乙二醛和二甲亚砜或甲基苯（不推荐）。

MOPS 胶的样品缓冲液： 0.75ml 去离子的甲酰胺，0.15ml 10 x MOPS, 0.24ml 甲醛， 0.1ml 去离子的无RNA酶的水，0.1ml 甘油， 0.08ml 10% (W/V) 澳酚蓝。分装小管后贮于－ 20℃, 或者每次现配。

加25 μI 样品缓冲液到5μ1 RNA 样品。可能需要浓缩RNA 样品。

样品缓冲液中的样品在65℃ 加热15min。加1μl mg/ml 溴化乙锭到每个样品，混匀。不需要将溴化乙锭加到电泳缓冲液中。

中型大小的胶，加5 ~ 20μg 总RNA, 小型胶加1~5 μg 。

加3 μg mRNA 与加5 ~ 20μg 总RNA 样相比，会得到更清晰的信号。

＊标准参照物／标记参照物

需要标准参照。

许多人利用样品本身的核糖体RNA作为大致的参照。真核生物核糖体RNA 是28S和18S （大致长5300 和2000 碱基）；原核生物核糖体RNA 是23S 和16S （大肠杆菌大致长3566 与1776 个碱基） 。

RNA 标准参照有商业制品。DNA 标准参照在甲醛胶中跑得不太好，不应使用。体外RNA 合成的指定模板可以用来合成长度确定的RNA 转录物，如果某未知RNA的长度必须要精确知道的时候可以采用。

溴酚蓝和二甲苯腈蓝可以用来做指示染料。就像在DNA 电泳中一样，其确切的位置取决于琼脂糖的品质与浓度（见表1) 。

表1 RNA 甲醛胶中跟踪染料的迁移

 甲醛胶

 二甲苯腈蓝溴酚蓝

SeaKem Gold  

1.0%6300660

1.5%2700310

2.0%1500200

SeaKem GTG 与LE  

1.0%4200320

1.5%1700140

2.0%82060a

SeaPlaque SeaPlaque GTG  

1.0%2400240

1.5%80080a

2.0%49030a

a 外推法确定的与染料迁移相当的核苷酸数。

＊样式

RNA 凝胶就像DNA 凝胶一样进行电泳。并不需要独立的胶盒与仪器。只要在电泳前后清洗胶盒就可以了。

＊缓冲液

10 x MOPS/EDTA 缓冲液，包含0.2mol/L MOPS (3 – 吗琳代丙磺酸）、50 mmol/L乙酸钠、10 mmol/ L EDTA, 调至pH7.0 。高压灭菌15min。时间长了呈现淡黄色是正常的。1 X 用于电泳。

MOPS 缓冲液（和其他RNA 缓冲液）离子强度很低，电泳过程中，沿着胶的长度方向会产生pH 梯度，导致胶的水解。只有在非常长的电泳过程中才可能出现，可以通过用蠕动泵循环缓冲液或者间歇性地把缓冲液从一端吸到另一端来避免这个问题。

＊凝胶

RNA 必须在变性条件下电泳。MOPS－甲醛胶是最安全***的一种。

甲醛胶必须在通风橱内倒胶，并静待固化。热的甲醛会蒸发，吸入很危险。做之前要请别人指导。

含甲醛的琼脂糖凝胶比普通琼脂糖凝胶易碎，必须小心操作。

1％或者1.2 ％的胶适用于大多数Northern 印迹。

＊电源

对电源的要求同DNA 琼脂糖凝胶。对于中等大小的胶， l00V （大约50 mA) 大约3~4 小时。

＊染色

由于溴化乙锭已包含在样品缓冲液中，不需要进一步染色。

＊分析

核糖体亚基应该是分开的。除非上样太多，否则各亚基不应该分不清楚，如果不能分清意味着降解。

mRNA, 如果在胶上可见，看起来像是一片糊状。

RNA电泳条带中的 28s 18s 5s分别代表什么？

RNA电泳条带中的 28s 18s 5s分别代表RNA电泳中核糖体RNA的大小。

Northern blot中最为常用的电泳胶是含有甲醛的琼脂糖凝胶，甲醛可以减少RNA的二级结构，电泳完成后的胶可经过EB染色后在紫外下检测RNA的质量。

对小分子的RNA 或者microRNA一般采用聚丙烯酰胺变性胶电泳。RNA电泳中可以依据核糖体RNA的大小大致判断条带的大小，28S RNA大小一般为5kb，18S RNA 大小一般为2kb。28S RNA 的亮度一般是18S 的两倍。

扩展资料

Northern blot 的优势在于它可检测目的片段的大小、是否具有可变剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用。

Northern blot中探针的序列需要和检测目的基因序列互补配对，探针可以是DNA、RNA或者其它的寡聚核苷酸，但最小的长度必须大于25bp，体外合成的RNA探针可以采用更高的退火温度来减少背景中的噪音。

探针一般采用P或者地高辛来进行标记。杂交过后，可采用X胶片显色的方法来检测信号。

参考资料来源：百度百科-northern blot

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