多聚甲醛固定后利用

多聚甲醛固定，确实是老生长谈，很多研究生在做实验时，可能很多师兄师姐都让他们用多聚甲醛固定，有些可能是为了长时间保存样本，希望集中起来染色，有些可能是染色后排不上队，想保持长时间质量稳定。于是就这么口口相传下来了。

预固定问题

做科研或临床时，可能很多FLOWER习惯性都会用4％多聚甲醛预先固定标本，可能出于三个目的： （1）为了灭活标本里面可能存在的微生物（细菌、病毒等），起到安全保障作用。 （2）希望标本能够较长时间存放。 （3）做胞内染色前的准备。 但是，可能很多人忽视了一点，就是如果在染色之前用多聚甲醛固定标本，细胞表面有些位点在固定后构象发生改变，使得抗体无法结合产生假阴性，也可能由于固定作用，导致其它位点产生非特异性结合（假阳性）。

因此，知道哪些抗体染色前不能预固定，十分重要。幸好，我们自己不用做验证，在Biolegend公司网站[1]，贴心的技术人员已经帮我们做了一系列测试，下面两张表，一张是人类抗原，一张是小鼠抗原，可以看的出来，大多数不能做预固定的抗体都是趋化因子受体，所以，大家在实验中千万要注意不要先固定后染色。

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表1、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（人类），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大

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表2、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（小鼠），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大

染色后固定问题

染色后的固定，就与抗原构象关系不大了，更多的是荧光素。以前4色以内的时候，用的荧光素都是非串联的，因此大多数影响不大，但随着各种新型串联染料的出现，多聚甲醛固定就成了问题了。

事实上，当你去搜索串联染色标记（如PE-cy7、APC-cy7等）的抗体时，会发现一些比较详细的描述里面会注明（以BD网站搜索APC-cy7各类抗体为例）：

Fixed cells should be ***yzed within 4 hours of fixation in paraformaldehyde or transferred to a paraformaldehyde-free buffer for overnight storage.

意思就是用多聚甲醛固定过的样本，必须在4小时内检测，否则容易导致串联染料降解，若要长时间保存，还是需要洗涤后，转移到不含多聚甲醛的缓冲液中。

需要注意的是，做GFP荧光检测的同学，也需要注意一下，多聚甲醛固定也会影响GFP，New York Medical College的P***l A Lucas认为是由于多聚甲醛固定后，并非使GFP荧光淬灭，而是使GFP蛋白构象发生改变，无法产生荧光[2]。有时候你固定后检测到的荧光可能是自发荧光，或剩余的未被改变构象的GFP发出的。

解决方案

1、如果检测的是前述表格中容易被多聚甲醛影响的分子，请尽量不要预固定，如需长期保存样本，可以考虑冻存单个核细胞。

2、如果检测的是前述表格中不会受多聚甲醛影响的分子，可用1％多聚甲醛预固定保存，但不能长时间使用，否则对细胞FSC、SSC和荧光强度影响大。此时可考虑使用流式中文网的FlowGuard®细胞保存液[3]，FlowGuard®是国内专利性原研产品，不含多聚甲醛，能缓释出一种特殊的弱固定成份，FSC的变化较多聚甲醛轻微，对抗原强度保持更长久，样本:保存液＝6:1～10:1，21天内检测结果稳定性好。

3、如果希望在染色后保持24小时左右的荧光稳定，仍首选建议：避光、4度，我们曾经在10色（BV405、KO、FITC、PE、ECD、PE-cy5.5、PE-cy7、APC、APC-A700、APC-cy7）流式方案非正式测试时，曾经测过数例，在避光、4度保存24小时后，荧光强度几乎无变化，细胞分群良好。 如果仍不放心，可考虑购买商品化的适用于串联染料的专用保存剂

巨噬细胞，不只M1和M2两种

专职的吞噬细胞具有高效的摄取已入侵固有免疫屏障的各种颗粒的能力， 这一功能为我们提供了保护，防止对健康产生危害。 单核吞噬系统包含了单核细胞、巨噬细胞和树突细胞（DC），其中单核细胞被认为是单核吞噬系统的前体细胞。 （不过，DC细胞也可能直接从DC前体细胞分化而来。）

图1、小鼠分化模型。骨髓中巨噬/树突状细胞前体可分化为Ly6C+CX3CR1loCCR2+CD62L+和Ly6CloCX3CR1hiCCR2−CD62L−两类单核细胞，进入循环中，其中Ly6C+CX3CR1loCCR2+CD62L+可进入各种组织中，变成巨噬细胞

不过值得一提的是，并非所有巨噬细胞均来自单核，例如那些组织驻留巨噬细胞（如中枢神经系统中的小胶质细胞等），其自我更新、增殖、起源和替代机制尚未完全阐明。

巨噬细胞的功能不仅限于吞噬和降解病原体，这些细胞也能够将自我与非自我区分开来，因此在某些组织发育中十分重要。

目前的巨噬细胞命名比较复杂，并且由于细胞功能多样，有时会导致混淆，因为巨噬细胞具有由微环境信号介导的功能可塑性。 通过一篇综述，流式中文网与大家一起复习一下巨噬细胞的分类，除了经典的M1、M2之外，还有肿瘤相关巨噬细胞、CD169＋巨噬细胞、TCR＋巨噬细胞。

M1巨噬细胞

M1巨噬细胞是可以产生促炎细胞因子的巨噬细胞，被称为经典型巨噬细胞，具有很强的杀死微生物特性，但是这些特异也容易引起组织破坏。

当细胞接受如下***时，可发生经典的巨噬细胞激活：（1）IFN-γ，主要由其他细胞类型（TH1细胞、细胞毒性T细胞和NK细胞）分泌; （2）脂多糖（LPS），革兰氏阴性细菌外膜的组分; （3）粒细胞-巨噬细胞集落***因子（GM-CSF），***产生促炎细胞因子。

M1巨噬细胞的特征在于分泌细胞因子如IL-1β、TNF、IL-12和IL-18的能力增强，在表型上，它们表达高水平的主要组织相容性复合体II类（MHC-II）、CD68标记和CD80、CD86共***分子。 最近，已经表明，M1巨噬细胞上调细胞内细胞因子信号传导抑制剂3（SOCS3）的表达，激活诱导型一氧化氮合酶（NOS2或iNOS）产生NO。 因此，在特定条件下，M1巨噬细胞加剧了对健康有害的炎症过程（35-37）。 然而，这些巨噬细胞也具有吞噬大量病原体的能力，并能杀死细胞内的细菌。

M1巨噬细胞与疾病

炎症性肠病（IBD） ：胃肠道的慢性复发性炎症。在IBD患者的小鼠模型和活组织检查中，都观察到SOCS3表达的增加，这与炎症的严重程度相关。此外，SOCS3表达已被建议作为急性或慢性炎症的细胞的有用标志物。

系统性红斑狼疮（SLE） ：是一种以慢性炎症为特征的自身免疫性疾病，患者表现出IFN-γ和IRF-5水平升高。

多发性硬化症（MS） ：CNS的脱髓鞘疾病。巨噬细胞在中枢神经系统中的作用似乎是双重的。最初，显示活化的单核细胞/巨噬细胞可能在MS急性加重期中起作用。然而，实验证据表明GM-CSF（M1感应器）是诱导轴突再生所必需的。

类风湿性关节炎（RA） ：一种自身免疫性疾病，其特征在于导致关节破坏的滑膜的慢性炎症。巨噬细胞数量与RA患者的疾病活动相关。

1型糖尿病 ：一种自身免疫性疾病，其特征在于产生胰岛素的胰腺β细胞（β细胞）耗竭，并因此导致高水平的葡萄糖。在高血糖条件下，IFN-γ/ STAT1依赖性通路的活性氧中间体的产生和凋亡增加。在小鼠模型中，已经显示β细胞增加CCL2的表达并使得胰腺中的促炎单核细胞募集和糖尿病的进展。现已发现，来自糖尿病小鼠的巨噬细胞内抗凋亡蛋白的表达水平增高，可能是促进巨噬细胞对β细胞攻击的潜在机制。

肥胖 ：已被认为是导致多种疾病（如2型糖尿病）的主要危险因素。Wei***erg等人显示在小鼠和肥胖人的脂肪组织中发现巨噬细胞数目增加，并且百分比与它们的肥胖水平正相关。从瘦动物的白色脂肪组织中分离的巨噬细胞表现出M2巨噬细胞的特征。此外，肥胖诱导M1巨噬细胞特征性分子（如编码TNF和NOS2的分子）的基因表达增加，这表明饮食诱导的肥胖可导致巨噬细胞的极化从M2向M1转变。

细胞内病原体感染 ：如结核分枝杆菌（结核分枝杆菌）或单核细胞增生利斯特氏菌（单核细胞增生利斯特氏菌）。结核分枝杆菌可抑制M1巨噬细胞功能，从而实现逃避免疫系统杀伤。单核细胞增生李斯特菌感染期间，枯否细胞的坏死可触发嗜碱性粒细胞产生IL-4，导致M1向M2巨噬细胞表型的转变，这些M2巨噬细胞可以代替死亡的枯否细胞，从而减轻炎症过程，维持肝脏动态平衡。

M2巨噬细胞

又称替代性活化巨噬细胞。已发现一些***因素如CSF-1、IL-4、IL-10、TGF-β和IL-13、真菌和蠕虫感染有利于M2亚群分化。

M2巨噬细胞在对寄生虫、组织重塑、血管生成和过敏性疾病的反应中起着核心作用。

表型上，该群体的特征在于巨噬细胞甘露糖受体（MMR）的表达，即CD206。然而，在2013年Jaguin等人观察到M1和M2巨噬细胞之间CD206表达没有差异，并提出M2巨噬细胞的特异性是CD200R膜糖蛋白的上调。 CD163被认为是M2标志物，但最近在人体组织中检测发现，CD163必须与转录因子CMAF联合使用，才能作为M2巨噬细胞标志物，所以单纯一个CD163不能认为是M2标志物。

M2巨噬细胞和疾病

过敏和哮喘： 过敏性哮喘是一种气道炎症性疾病，其特征在于对不同过敏原的反应性增加，以TH2免疫应答为主（表达IL-4、IL-5、IL-13）。目前，M2巨噬细胞如何对这种病理作出贡献还不完全清楚。在IL-4RαKO小鼠中使用卵白蛋白和屋尘螨诱导过敏性气道疾病的证据表明巨噬细胞精氨酸酶1+和Ym-1 +减少，但临床病理学上未见减少。因此，关于M2巨噬细胞在哮喘病理生理学中的作用的差异可能取决于不同的因素，包括***的性质和暴露的时间。

蠕虫感染： 蠕虫具有特殊的免疫策略，可以逃避宿主的免疫反应，并建立持续的感染。 M2巨噬细胞对于针对寄生虫的足够免疫应答是必需的，然而，M2巨噬细胞作用的确切机制尚未完全阐明。

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）

从严格意义上说，TAM并不被认为是巨噬细胞中的一个亚群，因为这些细胞不是在稳态条件下存在，而是在许多肿瘤中被观察到。 TAM是与特定病理情况相关的巨噬细胞，其活化状态类似M2巨噬细胞。然而，也有实验证据表明TAM不仅是一个独特的M2髓样细胞群体，而且还有同时具备M1和M2信号。

下表总结了TAM与M1、M2之间分子表达上的差异：

CD169＋巨噬细胞

抗原CD169或Siglec-1，最初是从骨髓、淋巴结、肝和脾中分离的一种巨噬细胞亚群发现的标记。这些细胞具有结合红细胞的能力。 淋巴结包膜下窦和髓质区、脾边缘区中的巨噬细胞高表达CD169。到目前为止，CD169 +巨噬细胞的信号传导途径和活化信息还不足，与M1、M2的对比也不甚清楚。

CD169＋巨噬细胞与红细胞生成、免疫耐受、肾脏疾病、抗病毒等密切相关。

TCR＋巨噬细胞

T细胞受体（TCR）是具有广泛抗原特异性的抗原识别所必需的分子，与CD3形成复合物。这种复杂的TCR-CD3由8条链组成：两条来自TCR，主要是αβ，偶尔有γδ，加上来自CD3的6条链：δε，γε和ζζ。多年来，普遍认同了TCR是T细胞唯一的，其他白细胞不能表达TCR。

然而，2006年有报道说，循环中的5-8％的中性粒细胞表达TCR-αβ复合物，中性性粒细胞中CD3依赖性TCR信号的参与，可抑制细胞凋亡并增加IL-8表达。此外，有少量嗜酸性粒细胞亚群，呈TCRγδ+和TCRαβ-，当这些嗜酸性粒细胞被CD3（非特异性***）活化时，可引起ROS、嗜酸粒细胞过氧化物酶（EPO）、嗜酸粒细胞源性神经毒素（EDN）和细胞因子的释放，当被分枝杆菌配体（特异性***）激活时，亦可产生ROS和EPO，但是不会释放细胞因子。此外，这个亚群还具有抗肿瘤细胞毒活性，因此嗜酸性粒细胞TCRγδ+与免疫防御有关。

关于巨噬细胞亚群，有些文献报道了人和鼠TCR +巨噬细胞的存在，这些TCR＋巨生细胞常表达γδ可变链，在细菌暴露后，会表达不同的TCRVδ库，表明TCRγδ能针对不同细菌发生不同的适应性改变。

可见，世界之大，无奇不有。人类的研究，总是一遍又一遍的刷新我们的世界观。你有什么话要说吗？

文献源：Chávez-Galán Leslie,Olleros Maria L,Vesin Dominique et al. Much More than M1 and M2 Macrophages, There are also CD169(+) and TCR(+) Macrophages.[J] .Front Immunol, 2015, 6: 263.

多聚甲醛固定后组织膨胀的原因

多聚甲醛之所以能够起到很好的固定效果，和它的制作工艺、物理性质和化学性质是分不开的。

多聚甲醛多制成多聚甲醛固定液来进行固定，多聚甲醛液的配方决定了多聚甲醛的固定性，多聚甲醛液中含有pbs溶液，HCL，这些溶液和多聚甲醛按照一定的方法混合在一起就具有了个定作用。

Cesium入门7 - Adding Terrain - 添加地形

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Cesium支持流式的、可视化的全球高程投影地形地势、水形数据，包括海洋、湖泊、河流、山峰、峡谷和其他能够被三维展示出来的且效果比二维好的地形数据。像图层数据一样，Cesium引擎会从一个服务器上请求流式地形数据，仅请求那些基于当前相机能看到的需要绘制的图层上的数据。

Cesium官方提供了一些地形数据集的例子，以及如何配置这些参数。

支持的地形数据格式

为了添加地形数据，我们需要创建一个 CesiumTerrainProvider ，提供一个url和一些配置想，然后将这个provider赋值给 viewer.terrainProvider 。

此处，我们使用 Cesium WorldTerrian 图层，该图层由Cesium ion提供，在“My Assets”中是默认提供的。我们可以用 createWorldTerrain helper函数创建一个由Cesium ion提供服务的 Cesium WorldTerrian 。

requestWaterMask 和 requestVertexNormals 是可选的配置项，告诉Cesium是否需要请求额外的水、光数据。这两个选项默认是设为false的。

最终，既然我们有了地形数据，我们需要更多的线条来使得地形数据背后的objects能够正确地显示，只有最前面、最上面的objects才能是可见的。

我们现在有地形数据和运动的水。纽约非常平坦，所以可以在上面的地形数据上自由的探索。举一个显而易见的例子，你可以跳转到更加崎岖的区域比如 Grand Canyon 或者 San Francisco。

关于地形数据的更多信息，请访问 Terrain Tutorial

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